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本制品是一种用荧光法快速高灵敏检测DNase I及其它脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)活性的试剂盒。

脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(RNase)类似，广泛存在于实验环境和生物物体中，由于核酸酶能够降解核酸，因此核酸酶的存在会对许多实验造成干扰。文献中常见的检测DNase的方法通常耗时长，并且检测灵敏度比较低。

最常见的DNase是DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1～2个核苷酸突出的粘末端。

DNase活性荧光检测试剂盒采用荧光共振能量转移(FRET)的方法，其检测原理如下图所示。DNase底物(DNase Substrate)是一种合成的DNA寡核苷酸探针，其一端具有VIC荧光基团(Fluorophore)又称供体(Donor)，另一端具有BHQ1淬灭基团(Quencher)又称受体(Acceptor)。这两个基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。VIC和BHQ1被连接到DNase的底物两端。当该底物被DNase切割后，DNA底物的首尾两端分离，两个基团分开，VIC的荧光不再被BHQ1淬灭，即可检测到VIC的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测DNase酶活性。VIC的最大激发波长为535nm，最大发射波长为556nm。试剂盒内提供DNase I标准品，可以通过设置标准曲线，计算出样品的DNase I的酶活性。

• 本试剂盒检测灵敏度高，样品用量少。本试剂盒中提供了DNase I作为阳性对照，便于检测体系的建立。同时对DNase底物探针进行了优化，灵敏度高，可以检测到低达约6×10^-4 U的DNase I，检测灵敏度高于常规同类产品。用户可以通过设置标准曲线，计算出样品中DNase I的活性。本试剂盒用于DNase I酶的检测结果参考图2。
  
  图2.本试剂盒对DNase I标准品的检测效果。图A为20分钟内本试剂盒检测不同量的DNase I的荧光强度变化图。图B为不同量的DNase I的初始反应速度，呈线性关系。图C为20分钟时本试剂盒检测不同量的DNase I的荧光值。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本试剂盒适用范围广，使用灵活，检测速度快。本试剂盒不仅可以用于检测DNase I，也可检测其它的DNase，包括可切割单链和双链DNA的核酸酶，相对于ELISA法更简单、更快速、更准确。已通过实验验证本试剂盒可以用于检测Benzonase类超级核酸酶、T4 DNA聚合酶、T5 Exonuclease、Micrococcal nuclease、Mung Bean Nuclease、S1 Nuclease等酶的相对活性。本试剂盒采用一步法检测，简单快速，全程仅需约20分钟即可完成。

组分	100T	500T
10×Reaction Buffer	2mL	10mL
DNase I (1U/μL)	20μL	100μL
5×DNase Substrate	200μL	1mL
无核酸酶水	20mL	100mL

保存：-20℃，有效期1年，其中5×DNase Substrate须避光保存。

• 由于本试剂盒的检测灵敏度非常高，而脱氧核糖核酸酶可能存在于环境中，因此建议在超净工作台或生物安全柜等相对洁净的环境中进行脱氧核糖核酸酶的活性检测，以免待检样品受环境中脱氧核糖核酸酶的影响。
  
• 10×Reaction Buffer、DNase Buffer和5×DNase Substrate需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。DNase I(1U/μL)使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
  
• 请确保样品pH值在7～8之间，或加入样品后反应体系的pH值在7～8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
  
• 本试剂盒可能对一些核酸酶不适用，例如，Klenow Fragment和Phi29 DNA聚合酶。一般情况下，本试剂盒中提供的10×Reaction Buffer对大多数核酸酶是通用的，但也存在对一些特定的酶不适用的情况。如有必要请用特定核酸酶的缓冲液对样品进行稀释和反应。
  
• 使用本试剂盒检测时请注意防止试剂被DNase污染，如有必要，每次实验可使用核酸酶喷雾清除剂(货号：YT400)清除环境中存在的DNase。
  
• 检测时建议使用96孔黑板，推荐选购黑色96孔板(货号：YTB002)。

• 试剂盒的准备：
  
  • 将10×Reaction Buffer、5×DNase Substrate和无核酸酶水平衡至室温后分别混匀备用。DNase I(1U/μL)存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • 将10×Reaction Buffer用无核酸酶水稀释为1×，例如取100μL 10×Reaction Buffer，加入900μL无核酸酶水，混匀即得1mL的1×Reaction Buffer。
    
  • 将5×DNase Substrate用1×Reaction Buffer稀释为1×，例如取20μL 5×DNase Substrate，加入80μL 1×Reaction Buffer，混匀即得100μL的1×DNase Substrate。
• 样品的准备：
  用1×Reaction Buffer将待测样品稀释至适当浓度(首次检测不确定浓度范围时，可以进行梯度稀释)，置于冰上备用。
  
• DNase I标准曲线的设置：
  注：本步骤为选做步骤，适用于样品中仅含DNase I时DNase I的定量检测或参照DNase I酶活性的其它DNase检测。
  将DNase I(1U/μL)用1×Reaction Buffer稀释至适当的浓度梯度。初次检测时可设置为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4mU/μL，分别取10μL加入96孔板中，此时，DNase I量分别为0、0.000625、0.00125、0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04U。也可自行设置适宜的DNase I浓度进行标准曲线的设定。
  
• 检测体系的设置：
  参照下表依次加入试剂盒各组分及样品。初次检测时，待测样品可进行适当稀释。
  

  Reagent	Blank Control	Positive Control	Sample
  1×Reaction Buffer	90μL	80μL	80μL
  DNase I	0	10μL	0
  Sample	0	0	10μL
  1×DNase Substrate	10μL	10μL	10μL
  总体积	100μL	100μL	100μL

  • 为获得更加可靠的检测结果，建议每个样品设置平行孔或3个复孔。
    
  • 若已经制作了DNase I标准曲线，则无需设置阳性对照。
  
  
• 检测：
  
  • 振荡混匀1～2分钟，确保混合充分。
    
  • 混匀后立即使用荧光酶标仪进行荧光测定。设置荧光酶标仪温度为37℃，激发波长为535nm、发射波长为556nm，每5分钟或10分钟读取一次数值。
    
    • 连续测定的时间可以根据待测样品中DNase活性进行适当调整，但是需确保获得6个点以上的数据。对于DNase的酶活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟；对于DNase的酶活性很低的样品，可以延长测定总时间为1小时，对应的测定间隔时间设为5或10分钟。
      
    • 如果荧光酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的实验条件偏低的程度会有所不同。
• 计算：
  根据检测出来的荧光强度比较样品中DNase的相对酶活。若进行DNase I检测时，可通过绘制的标准曲线及样品荧光强度值进行样品中DNase I酶活的计算。本试剂盒用于DNase I标准品的检测结果参考图2。

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